納米材料對厭氧氨氧化菌的影響
納米材料由于其獨特的性質(zhì)已被廣泛使用，其應(yīng)用過程中的副產(chǎn)品之一就是納米顆粒，納米顆粒粒徑通常在40～100nm之間，其中40～60nm的納米顆粒占比達(dá)到了46.1%。在制造、運輸和應(yīng)用的過程中，納米顆粒（Nanoparticles，NPs）不可避免地會被釋放到環(huán)境中，最終在污水中被無害化處理。
現(xiàn)階段，在許多污水中都能檢測到納米顆粒的存在，例如在紡織廢水中，納米氧化鋅累積濃度可達(dá)到150μg/L。而市政污水中納米銀的濃度范圍主要在0.1～0.2μg/L之間，同時在市政污水中檢測到納米二氧化鈦的濃度為181～1233μg/L，這是由于納米二氧化鈦在醫(yī)藥、表面涂料和化妝品中被廣泛使用。盡管目前污水中部分納米顆粒的濃度還未達(dá)到較高水平，但是隨著納米科技的快速發(fā)展，含納米材料的消費品將呈顯著上升趨勢，納米顆粒在環(huán)境中的濃度將不斷增加，其對污水處理的潛在影響不能被忽視。
厭氧氨氧化（AnaerobicAmmoniumOxidation，Anammox）作為一種新型的自養(yǎng)脫氮工藝，被認(rèn)為是最高效、最具經(jīng)濟(jì)效益的污水脫氮技術(shù)之一。然而，厭氧氨氧化菌很容易受到進(jìn)水水質(zhì)波動的影響，污水中的納米顆粒會對其產(chǎn)生正面或負(fù)面的影響。
到目前為止，許多試驗研究結(jié)果表明納米材料對細(xì)菌、藻類和哺乳動物都具有一定的毒性，但是不同類型的納米材料之間的毒性效果并不一致。為此，筆者從厭氧氨氧化工藝的角度出發(fā)，結(jié)合現(xiàn)有研究文獻(xiàn)，從長期和短期影響、毒性機(jī)理、微生物的抗毒機(jī)制等角度綜述納米顆粒對厭氧氨氧化過程的影響，同時還提出今后的發(fā)展趨勢和研究方向。
1、納米材料對厭氧氨氧化菌活性的影響
根據(jù)最近的納米技術(shù)與材料消費品目錄，金屬和金屬氧化物納米材料是使用最廣泛的兩種納米材料，占全球納米產(chǎn)品總量的37%。不同納米材料的理化性質(zhì)隨著尺寸、形狀、化學(xué)成分和表面結(jié)構(gòu)而變化，因此，上述這些材料對厭氧氨氧化菌所造成的影響也不盡相同。
納米材料的一些常見特點（如表面、形態(tài)、材質(zhì)、特性等）見圖1。
1.1 金屬納米材料
在厭氧氨氧化系統(tǒng)中，Cu、Fe和Ag是研究最廣泛的三種金屬納米材料，Gonzalez Estrella等研究表明，0.50mmol/L的納米銅顆粒（CuNPs）使厭氧氨氧化菌的活性降低了82.9%。Zhang等的試驗得到了類似結(jié)果，CuNPs在短期試驗（4h）中顯著抑制了厭氧氨氧化活性，而長期暴露于5mg/L的CuNPs使得反應(yīng)器在30d內(nèi)幾乎失去了所有的脫氮能力。零價納米鐵（nZVI）與CuNPs不同，nZVI對厭氧氨氧化菌的生長具有促進(jìn)作用，在暴露于低濃度nZVI（濃度<5mg/L）條件下，厭氧氨氧化菌活性（SAA）顯著提高，因此nZVI可以加速厭氧氨氧化系統(tǒng)的啟動。然而短期高濃度nZVI釋放的可溶性亞鐵離子可能對厭氧氨氧化菌產(chǎn)生危害，但是損害是可恢復(fù)的。納米銀顆粒（AgNPs）由于其具有抗菌能力對微生物具有較大的毒性。Li等在AgNPs對厭氧氨氧化的影響研究中得出，短期低濃度（1mg/L）的AgNPs暴露對厭氧氨氧化系統(tǒng)沒有明顯的抑制作用，提高AgNPs濃度（10mg/L）后厭氧氨氧化菌受到抑制，并且隨著暴露時間的延長系統(tǒng)脫氮能力并沒有得到恢復(fù)。
1.2 金屬氧化物納米材料
金屬氧化物納米材料的毒性不同于金屬納米材料。例如，Zhang等對比了納米氧化銅（CuONPs）和CuNPs對厭氧氨氧化的短期和長期影響。結(jié)果表明，CuONPs對厭氧氨氧化菌長期和短期活性的抑制作用均大于CuNPs，長期暴露于CuONPs中總氮去除效率最低降至14%，脫氮能力顯著下降。
其他金屬氧化物納米顆粒對厭氧氨氧化系統(tǒng)的影響也不盡相同。研究發(fā)現(xiàn)，ZnONPs短期內(nèi)對厭氧氨氧化過程具有抑制作用，然而ZnONPs的長期抑制作用是可逆的，并且通過增加氨氮濃度，可以緩解ZnONPs對厭氧氨氧化系統(tǒng)的抑制作用。Xu等在NiONPs作為抑制劑的試驗中發(fā)現(xiàn)，在添加的NiONPs濃度為2～10mg/L時，總氮去除效率小幅提升。反應(yīng)器性能的提升可能與NiONPs釋放Ni2+有關(guān)，因為低水平的Ni2+是厭氧氨氧化菌的一種必需的微量營養(yǎng)元素，而高濃度的NiONPs顯著抑制了厭氧氨氧化菌活性。此外，還有多種金屬氧化物納米顆粒會對厭氧氨氧化菌群落結(jié)構(gòu)和污泥性質(zhì)產(chǎn)生負(fù)面影響，如SiO2、CeO2、Al2O3、TiO2等，它們對厭氧氨氧化菌的抑制順序為：SiO2>CeO2>Al2O3>TiO2。這可能是由于它們獨特的物理和化學(xué)性質(zhì)決定了它們釋放金屬離子的能力以及與微生物的相互作用。
2、納米材料對厭氧氨氧化菌影響的作用機(jī)理
納米材料的生物毒性一般與細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的破壞有關(guān)。納米材料對厭氧氨氧化系統(tǒng)影響的作用機(jī)理主要分為金屬離子的釋放以及納米效應(yīng)兩大類，在厭氧氨氧化菌接觸到有毒納米顆粒之前，其細(xì)胞外層的胞外聚合物（EPS）會先吸附納米顆粒及其釋放出的金屬離子，在納米顆粒與細(xì)胞膜接觸后，通過細(xì)胞中的金屬蛋白酶（一種轉(zhuǎn)運酶）發(fā)生跨膜運輸，在細(xì)胞體內(nèi)累積并產(chǎn)生毒性，其影響在厭氧氨氧化菌中則表現(xiàn)為細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的破壞、毒性中間產(chǎn)物的積累和代謝破壞，如圖2所示。事實上，某些納米顆粒對微生物的毒性可能涉及上述一種或多種途徑。
2.1 金屬離子的釋放
許多研究表明，納米顆粒在缺氧或無氧條件下的抗菌機(jī)理歸因于有毒金屬離子的釋放。從納米顆粒中釋放出來的金屬離子比納米顆粒更容易滲透到細(xì)胞內(nèi)部，從而產(chǎn)生毒性。溶解的金屬離子會大量附著在細(xì)胞表面，然后滲透到細(xì)胞中，導(dǎo)致金屬離子在細(xì)菌細(xì)胞質(zhì)中的積累。影響金屬離子釋放量的因素包括納米材料類型、溶解氧、pH值等。
釋放的金屬離子對厭氧氨氧化菌的不利影響之一是導(dǎo)致關(guān)鍵酶失活。例如，90%以上溶解的Cu2+離子存在于污泥中，而不是液相或出水中。CuNPs釋放的可溶性Cu2+離子可破壞細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞溶解，并由于銅與其他蛋白質(zhì)功能組的親和力而導(dǎo)致酶功能的破壞，從而擾亂厭氧氨氧化菌的代謝。類似情況如ZnONPs對厭氧氨氧化菌的抑制也是由于其在液相中的溶解釋放了有毒的Zn2+離子。據(jù)測算，1.0、5.0和10mg/L的ZnONPs溶解所產(chǎn)生的Zn2+離子濃度分別為0.5、2.7和4.1mg/L。又例如，NiONPs對厭氧氨氧化系統(tǒng)的促進(jìn)作用是由于其釋放出的Ni2+為微生物生長所必需的營養(yǎng)元素。有研究表明，60mg/L的NiONPs釋放的Ni2+濃度為（13.53±4.29）mg/L。同樣對厭氧氨氧化菌具有促進(jìn)作用的還有nZVI溶解反應(yīng)產(chǎn)生的溶解態(tài)Fe2+，這主要是因為鐵是許多含血紅素酶的關(guān)鍵成分，這些酶在厭氧氨氧化菌分解代謝中有著重要的作用。
值得注意的是，厭氧氨氧化反應(yīng)會導(dǎo)致堿度增加，以及由于配體交換或靜電吸引作用，大量的納米顆粒在細(xì)胞表面聚集或沉淀，然后與EPS、SMP甚至細(xì)胞膜功能基團(tuán)相互作用，這些過程均可以加速納米顆粒中金屬離子的釋放。
2.2 活性氧簇及乳酸脫氫酶的抑制作用
活性氧簇（ReactiveOxygenSpecies，ROS）又稱活性氧自由基。在關(guān)于納米顆粒毒性的研究中，ROS被認(rèn)為是產(chǎn)生微生物毒性和細(xì)胞損傷的主要原因之一。由于光照是ROS產(chǎn)生的前提條件，因此在厭氧氨氧化的避光環(huán)境中，即使水體中存在納米顆粒，也不會產(chǎn)生光催化活性氧。然而微生物的生命活動會產(chǎn)生胞內(nèi)活性氧，同時有研究證實納米顆粒的存在會誘導(dǎo)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和累積，高水平的ROS含量會對脂質(zhì)和細(xì)胞膜造成氧化損傷，誘導(dǎo)一系列細(xì)胞內(nèi)反應(yīng)，進(jìn)而影響微生物的正常代謝。Hou等在CuONPs對厭氧氨氧化的影響研究中發(fā)現(xiàn)，納米顆粒會導(dǎo)致活性氧自由基的生成和乳酸脫氫酶（LDH）的釋放，加入50mg/L的CuONPs后，ROS濃度比對照組提高了35.01%，而LDH濃度提高了51.18%。LDH的濃度表征了細(xì)胞膜的完整性，LDH的釋放意味著細(xì)胞膜被破壞，從而對細(xì)胞產(chǎn)生了不可逆的損害。同時通過DNA測序?qū)ξ⑸锶郝渥兓难芯勘砻靼毖趸?xì)菌（AOB）的增殖與厭氧氨氧化菌（AAOB）的抑制，推測是由于CuONPs促進(jìn)了氧氣從空氣向反應(yīng)器的轉(zhuǎn)移導(dǎo)致的。Zhao等在ZnONPs的研究中也證實了ROS的毒性作用，相比于空白對照，50mg/L的ZnONPs會使反應(yīng)器中的ROS含量提高40%，ROS的存在代表著納米顆粒對厭氧氨氧化菌的氧化應(yīng)激作用，它不僅會破壞細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)和功能，還會引起糖鏈斷裂，從而對厭氧微生物產(chǎn)生毒害作用。然而ZnONPs的加入不會導(dǎo)致LDH的釋放，這意味著細(xì)胞膜的完整性未被破壞，這說明其對厭氧氨氧化菌的抑制是可逆的。
3、厭氧氨氧化菌抗納米材料毒性的機(jī)制
厭氧氨氧化菌在受到環(huán)境污染物脅迫時，會產(chǎn)生一系列保護(hù)機(jī)制來免受毒害作用。例如在受到納米顆粒的毒性影響時，厭氧氨氧化菌會通過分泌EPS、上調(diào)抗性基因的表達(dá)等方法來保護(hù)自己。
3.1 增加EPS分泌
相較于其他微生物，厭氧氨氧化菌周圍會存在更多的EPS。例如，在活性污泥法的SBR反應(yīng)器中污泥中的EPS濃度為53.38mg/gVSS，MBR反應(yīng)器中則為91.94mg/gVSS，而在厭氧氨氧化體系中，污泥中的EPS濃度通常在200mg/gVSS以上，細(xì)胞周圍的EPS可以通過吸附納米顆粒來阻止其破壞細(xì)胞膜，從而減輕納米顆粒的毒性。EPS通常被認(rèn)為是保護(hù)厭氧氨氧化菌免受納米顆粒毒性的第一道屏障。
Zhang等在AgNPs對厭氧氨氧化菌的影響研究中發(fā)現(xiàn)，EPS可以作為吸附載體和滲透屏障，減少AgNPs與厭氧氨氧化細(xì)胞的直接接觸和相互作用，從而阻隔或緩解其對細(xì)胞的毒性。在投加50mg/L的AgNPs后，液相中的Ag濃度低于檢測限，而厭氧氨氧化顆粒中的銀含量從（2.7±0.2）mg/gSS增加到（110.5±7.8）mg/gSS，說明大部分游離的AgNPs都被細(xì)胞外圍的EPS吸附，這與Peng等的試驗結(jié)果一致。另外，通過X射線斷層攝影技術(shù)觀察到的厭氧氨氧化顆粒的微觀結(jié)構(gòu)表明，納米顆粒的加入會使微生物的胞外聚合物密度降低，從而產(chǎn)生孔隙，而這些孔隙是底物和代謝物運輸?shù)耐ǖ??？紫堵实脑黾訉嶋H上提高了厭氧氨氧化顆粒中的基質(zhì)轉(zhuǎn)移效率，從而提高了微生物的活性。類似地，Xu等在投加MnO2NPs后也觀察到EPS濃度的增加。對污泥中EPS的定量分析表明，在投加納米顆粒后，顆粒污泥中EPS的含量從360.2mg/gVSS增加到481.5mg/gVSS，厭氧氨氧化菌傾向于分泌更多的EPS，以應(yīng)對納米顆粒不斷增加產(chǎn)生的毒性。這種行為被認(rèn)為是微生物的一種防御機(jī)制，通過增加EPS分泌來減少與納米顆粒的直接接觸和相互作用，從而形成保護(hù)性的“繭”。
此外，Zhang等在磁鐵礦納米顆粒（MHNPs）對厭氧氨氧化的研究中發(fā)現(xiàn)，MHNPs的加入使得厭氧氨氧化污泥中的EPS含量從196.5mg/gVSS增加至272.6mg/gVSS，這表明MHNPs會導(dǎo)致細(xì)菌加速EPS的分泌，并且EPS含量的增加可以加速絮凝污泥的造粒過程，因此MHNPs可以改善厭氧氨氧化絮凝污泥的沉降性能，同時對微生物群落的功能特異性也有一定的增強(qiáng)。不同納米材料對厭氧氨氧化菌EPS分泌的影響見表1。
從表1可以看到，不同類型的納米顆粒的影響不盡相同，通常來說納米顆粒毒性越強(qiáng)，其對厭氧氨氧化菌分泌EPS的刺激效果越顯著，EPS含量增加13.3%~67.3%。
值得注意的是，Zhou等的研究證實CuONPs對厭氧氨氧化的抑制很大程度上是由于納米效應(yīng)，粒徑越小，影響越嚴(yán)重。試驗表明，相同濃度下40nm尺寸的CuONPs對厭氧氨氧化活性的影響（脫氮效率下降61%）遠(yuǎn)大于200nm（脫氮效率下降33%），這一方面是由于粒徑較大的納米顆粒更易聚集為沉淀物，從而通過出水排出；另一方面是由于大粒徑的納米顆粒會被EPS吸附，無法進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，而小粒徑有助于穿透EPS所組成的屏障，從而對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用。此研究也從側(cè)面說明了EPS對厭氧氨氧化菌的保護(hù)作用。
3.2 調(diào)控基因的表達(dá)
在納米顆粒對厭氧氨氧化系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用后，厭氧氨氧化菌可以通過上調(diào)相關(guān)功能基因或者抗性基因的豐度來抵抗這種抑制作用，從而保證細(xì)菌細(xì)胞的生存。例如，長期暴露于低于抑制濃度的納米銀顆粒中，可以促使厭氧氨氧化菌激活基于基因表達(dá)的離子轉(zhuǎn)運調(diào)節(jié)，用于抵抗納米銀的毒性。
在厭氧氨氧化菌的代謝途徑中，通過肼合酶（hydrazinesynthase，hzsA）可以將一氧化碳和銨合成為肼（N2H4），肼合酶是一種獨特的只存在于厭氧氨氧化菌中的酶，因此通過測定hzsA基因的豐度可以表征厭氧氨氧化菌中肼合酶的豐度，從而定量評估厭氧氨氧化菌的活性。例如，在Zhang等對ZnONPs的研究中，加入納米顆粒前后，hzsA基因的拷貝數(shù)維持不變，均在5.5×109copies/gVSS左右，然而hzsA基因的相對豐度在受到?jīng)_擊時從32%降至28%，并且在隨后的恢復(fù)階段上升至36%，可以看出恢復(fù)的厭氧氨氧化生物量具有比沖擊前更高的hzsA基因豐度。
與此相似，在MHNPs對厭氧氨氧化的影響中也觀察到了類似的結(jié)果，在進(jìn)水MHNPs濃度增加至200mg/L后，hzsA基因的含量從5.03×109copies/gVSS增加到7.12×109copies/gVSS，相對豐度從17.7%增加至39.2%。這說明在受到諸如納米顆粒的污染物沖擊后，厭氧氨氧化菌傾向于產(chǎn)生更多肼合酶來加速繁殖，以獲得更多的微生物量來抵抗納米顆粒的毒性。
Li等在研究Fe3O4NPs對厭氧氨氧化工藝的影響中也觀察到了類似的現(xiàn)象。在低濃度（1mg/L）Fe3O4NPs的暴露下，厭氧氨氧化菌中的離子轉(zhuǎn)運與脂質(zhì)代謝的基因豐度相較對照組分別從4.85%和3.1%增至5.25%和3.5%，這是由于亞鐵離子作為一種厭氧氨氧化菌所需要的微量元素，其需要鐵轉(zhuǎn)運蛋白來進(jìn)行攝取。然而在過高濃度（10mg/L）的Fe3O4NPs脅迫下，離子轉(zhuǎn)運與脂質(zhì)代謝的基因豐度均會下調(diào)，證明厭氧氨氧化細(xì)菌可以通過下調(diào)與鐵轉(zhuǎn)運相關(guān)的基因來防止細(xì)胞內(nèi)過量鐵的積累。
對于一部分具有毒害作用的納米顆粒，厭氧氨氧化菌還會通過上調(diào)相關(guān)抗性基因的豐度來保護(hù)自己。已有研究表明，厭氧氨氧化菌對ZnONPs的間歇性擾動有著很強(qiáng)的適應(yīng)能力。為了減輕過量Zn2+離子造成的毒性損害，厭氧氨氧化菌可能通過上調(diào)ZntA基因（一種Zn2+離子轉(zhuǎn)運蛋白的表達(dá)基因）的豐度，從而增加Zn2+離子的排出量。與ZnONPs類似，Zhang等在向厭氧氨氧化系統(tǒng)中加入1mg/L的CuNPs后發(fā)現(xiàn)，copA基因的相對表達(dá)量從對照組的3.56×10-4增加到12.4×10-4。copA基因可以促使厭氧氨氧化菌細(xì)胞中產(chǎn)生更多外排酶將有毒的Cu2+離子從細(xì)胞內(nèi)排除到周質(zhì)空間，從而達(dá)到減毒的作用。Peng等對加入AgNPs后厭氧氨氧化菌中的差異表達(dá)蛋白的分析結(jié)果表明，相較于沒有加入AgNPs的對照組，KEGG數(shù)據(jù)庫中的550個差異表達(dá)蛋白中有344個是上調(diào)蛋白，而下調(diào)蛋白有206個，說明AgNPs的加入導(dǎo)致某些功能蛋白的上調(diào)表達(dá)，加快了厭氧氨氧化菌的生長速度和豐度。
4、結(jié)語
隨著納米科技的快速發(fā)展，越來越多的納米材料被大規(guī)模應(yīng)用，厭氧氨氧化作為一種新型的污水脫氮工藝，污水中日益增加的納米顆粒對其影響已經(jīng)不可忽視。大多數(shù)金屬納米材料與金屬氧化物納米材料通過納米效應(yīng)、重金屬離子的釋放等作用均會對厭氧氨氧化過程產(chǎn)生抑制，在較高濃度下甚至?xí)?dǎo)致厭氧氨氧化菌的死亡。
在受到納米顆粒的脅迫時，厭氧氨氧化菌會通過增加EPS的分泌來阻止其與細(xì)胞的接觸，同時通過上調(diào)功能基因（如hzsA基因）與抗性基因（如ZntA、copA基因）的表達(dá)來達(dá)到減毒的作用。然而現(xiàn)有研究大多集中在納米材料對厭氧氨氧化工藝的影響過程及機(jī)理方面，對于實際工程應(yīng)用方面仍研究較少，針對現(xiàn)有研究成果，提出以下幾點未來的研究方向：
①大多數(shù)金屬（氧化物）納米材料由于其獨特的物化性質(zhì)（納米效應(yīng)、重金屬毒性等）而會抑制厭氧氨氧化過程，但是有相當(dāng)一部分納米材料不僅不會抑制厭氧氨氧化反應(yīng)，反而還會促進(jìn)其活性，如納米零價鐵、納米氧化石墨烯等。如何利用這些材料來縮短厭氧氨氧化反應(yīng)器的啟動周期或是提高厭氧氨氧化工藝的處理效率則是今后重要的研究方向。
②現(xiàn)有研究內(nèi)容大多局限于小試規(guī)模的小型反應(yīng)器，可以進(jìn)一步增加對中試或工業(yè)化應(yīng)用的厭氧氨氧化系統(tǒng)中納米顆粒的影響研究。
③各種環(huán)境條件，包括溫度和污水成分（如重金屬、有機(jī)物、抗生素等）都會對厭氧氨氧化菌的活性產(chǎn)生影響，納米材料與這些因素對厭氧氨氧化過程的復(fù)合影響仍需進(jìn)一步研究。（來源：同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院污染控制與資源化研究國家重點實驗室，上海污染控制與生態(tài)安全研究院）