利用活性污泥法處理工業(yè)廢水具有處理效果好、運行管理方便等優(yōu)勢，通常認為厭氧污泥微生物的正常生化處理應滿足BOD5∶N∶P=（200~300）∶5∶1，但是隨著人類活動的加劇，許多工業(yè)廢水（如釀造廢水）都存在磷元素缺乏的問題。啤酒廢水作為常見的低磷特種廢水也面臨處理難度大的問題。上流式厭氧污泥床反應器（UASB）是目前較為常見的厭氧生物處理技術(shù)之一，被廣泛用于工業(yè)廢水的處理中。

為了探究低磷啤酒廢水厭氧處理階段的微生物種類及群落多樣性，筆者將本溪某啤酒廠的低磷特種廢水處理工藝中獲取的厭氧污泥接種于實驗室UASB反應器中，培養(yǎng)馴化直至運行穩(wěn)定，對低磷厭氧污泥中的細菌和古細菌進行高通量測序分析，以期為磷營養(yǎng)源缺乏的厭氧生物處理機制及其技術(shù)改良提供參考。

1、材料與方法

1.1 試驗裝置

以本溪市某啤酒廠污水站厭氧罐中穩(wěn)定的厭氧污泥作為接種污泥，采用模擬啤酒廢水在實驗室的UASB裝置中進行馴化。UASB試驗裝置的有效容積為1.96L，連續(xù)進水，流量為15~25mL/min，溫度控制在30~40℃，放置在陰涼而且沒有陽光直射的位置。

UASB裝置進水為模擬低磷啤酒廢水，其COD、NH4+-N、TP濃度分別為1100~1500、20~24、3~3.2mg/L，pH為7.5~8.0，微量元素適量。

1.2 樣本的采集

厭氧污泥樣本取自啟動后的耐低磷菌馴化UASB試驗裝置。取反應器上端（YJR1）和下端（YJR2）兩處污泥，充氮后存于0℃冰盒中，并快速轉(zhuǎn)移至-20℃超低溫冰箱至送檢。

1.3 高通量測序及數(shù)據(jù)分析

1.3.1 DNA擴增

對污泥樣本中的細菌和古細菌進行高通量測序分析。針對污泥樣本中目標基因組16SrDNA的V3及V4區(qū)進行擴增，PCR模板為污泥樣本中提取的DNA原液，利用16SrDNA正反兩種引物即341F（CCTACGGGNGGCWGCAG）和805R（GACTACH?VGGGTATCTAATCC）進行擴增。根據(jù)PCR擴增圖譜，擴增后出現(xiàn)明顯清晰的條帶并且位置一致，證明PCR模板達到了擴增的濃度要求。本試驗委托上海生工生物公司對污泥樣本進行IlluminaMiSeq高通量測序。

1.3.2 操作分類單元（OTU）分類

將所有樣本序列按照序列間的距離進行聚類，然后根據(jù)序列之間的相似性分成不同的操作分類單元（OTU）。通過繪制OTU數(shù)量與聚類similarity值之間的關(guān)系圖，選出最佳的similarity值進行OTU分析和分類學分析。通常取相似水平為97%的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析。根據(jù)OTU列表中各樣本的物種豐度情況，應用軟件mothur，計算種群豐富度指數(shù)即Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)，指數(shù)值越大，說明群落豐富度越高；同時，計算群落多樣性指數(shù)即Shannon指數(shù)，Shannon指數(shù)值越大，說明群落多樣性越高。

2、結(jié)果與分析

2.1 UASB啟動及耐低磷厭氧菌馴化

UASB系統(tǒng)從啟動到穩(wěn)定，歷時約60d，分為3個階段：馴化期、提高負荷期、穩(wěn)定負荷期。啟動階段COD濃度的變化如圖1所示。前10d為馴化期，在這期間COD去除率較低，有細小的分散污泥被洗出。經(jīng)過提高負荷期和穩(wěn)定負荷期，60d之后反應器不再有絮狀污泥洗出，污泥呈顆粒狀，COD去除率穩(wěn)定在70%左右，基本符合啤酒廢水處理廠的COD去除狀態(tài)，證明UASB反應器順利啟動，馴化完成。

2.2 細菌分析

兩個污泥樣本的微生物豐富度和多樣性指數(shù)分析結(jié)果如表1所示?？芍瑯颖?/span>YJR2的Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)都高于樣本YJR1，這說明樣本YJR2的微生物菌群豐富度更高；此外，樣本YJR2的Shannon指數(shù)高于樣本YJR1，說明樣本YJR2的微生物多樣性更高。

2.2.1 門水平的優(yōu)勢

菌群分布特征污泥樣本中細菌在門水平上的群落結(jié)構(gòu)分布如圖2所示。

由圖2可知，污泥樣本中細菌在門水平上具有較高的多樣性，達到35個門以上，取TOP10進行分析。綠彎菌門（Chloroflexi）在樣本YJR1和YJR2中占比最大，分別為44.36%和46.57%，具有生物除磷功能，其在中低溫環(huán)境中迅速繁殖、在高溫環(huán)境中迅速衰亡；變形菌門（Proteobacteria）的占比為10.41%（YJR1）和14.95%（YJR2），具有一定的脫氮除磷能力，在地下水的微生物群落中占絕對優(yōu)勢；綠菌門（Chlorobi）的占比為15.32%（YJR1）、10.54%（YJR2），其可進行不產(chǎn)氧光合作用；廣古菌門（Euryarchaeota）的占比為11.62%（YJR1）和9.85%（YJR2），包含了古菌中的大多數(shù)種類，其中包括產(chǎn)甲烷菌；厚壁菌門（Firmicutes）的占比為5.96%（YJR1）和5.11%（YJR2），是腸道常見菌，包含好氧反硝化菌，與COD的降解去除有關(guān)；擬桿菌門（Bacteroidetes）為腸道常見菌，可水解纖維素等多糖物質(zhì)，具有硝化及反硝化除磷作用，占比為4.09%（YJR1）、4.47%（YJR2）；互養(yǎng)菌門（Synergistetes）的占比分別為1.52%（YJR1）和1.63%（YJR2），其可在厭氧消化反應器中降解污泥產(chǎn)生沼氣；浮霉菌門（Planctomycetes）的占比為0.4%（YJR1）和0.48%（YJR2），是兼性厭氧菌，可利用糖類作為主要碳源，能夠降解有機物，參與氮循環(huán)；酸桿菌門（Acidobacteria）的占比分別為0.26%（YJR1）和0.51%（YJR2），大多為嗜酸菌，可降解纖維素等復雜有機物，是有益的腸內(nèi)菌；candidatedivision在兩個樣本中的占比均為0.25%，常見于活性污泥和雨林土壤中。

2.2.2 屬水平的優(yōu)勢菌群分布特征

污泥樣本中細菌在屬水平上的群落結(jié)構(gòu)分布見圖3。污泥樣本中細菌在屬水平上具有較高的多樣性，達到270個屬以上。TOP10包括Chlorobium、Longilinea、Methanothrix、Levilinea、Acidovorax、Thauera、Acidaminobacter、Desulfomicrobium、Chlorobaculum、Aminivibrio。其中Chlorobium和Chlorobaculum屬于綠菌門（Chlorobi）；Longilinea、Levilinea屬于綠彎菌門（Chloroflexi）；Acidovorax、Acidaminobacter屬于厚壁菌門（Firmicutes）；Thauera、Desulfomicrobium屬于變形菌門（Proteobacteria）。

Chlorobium的占比分別為13.83%（YJR1）和9.88%（YJR2），硫細菌屬于該屬，具有厭氧光合產(chǎn)甲烷的功能特點；Longilinea的占比分別為10.11%（YJR1）和11.7%（YJR2），具有代謝多種碳水化合物、與產(chǎn)甲烷菌共培養(yǎng)時促進其生長的作用；Methanothrix屬于廣古菌門（Euryarchaeota），占比為11.52%（YJR1）和9.76%（YJR2），能夠?qū)⒁宜岱纸鉃?/span>CH4和CO2；Levilinea占比為9.51%（YJR1）和4.44%（YJR2），能代謝多種碳水化合物生成有機酸；Acidovorax占比為5.47%（YJR1）和4.6%（YJR2），是兼性厭氧菌屬；Thauera占比為0.35%（YJR1）和2.83%（YJR2），為兼性反硝化菌，具有脫氮及合成內(nèi)碳源的功能；Acidaminobacter占比為1.05%（YJR1）和1.79%（YJR2），為專性厭氧菌，能代謝碳水化合物生成有機酸；Desulfomicrobium占比為0.15%（YJR1）和2.11%（YJR2），嚴格厭氧而且活性較強的硫酸鹽還原菌屬于該菌屬；Chlorobaculum占比為1.48%（YJR1）和0.66%（YJR2），是厭氧菌，可以還原硫化合物，利用光自養(yǎng)生長；Aminivibrio屬于互養(yǎng)菌門（Synergistetes），占比為0.93%（YJR1）和0.98%（YJR2），是能發(fā)酵氨基酸和有機酸的厭氧細菌屬。

根據(jù)以上分析，可以歸納出污泥樣本中細菌的主要功能特點：可以分解代謝多種碳水化合物生成有機酸、硫以及硫酸鹽等。啤酒的主要生產(chǎn)原料是玉米和大麥，將玉米、大麥粉碎后加入啤酒花和鮮酵母對其進行糖化處理、發(fā)酵，在此過程中產(chǎn)生的廢水主要有浸麥廢水、糖化和發(fā)酵廢液、糖化與發(fā)酵階段的洗滌廢水、冷卻水等。由于啤酒加工工藝的特殊性，其產(chǎn)生的廢水主要成分相比常規(guī)的厭氧廢水含有更多的糖類和蛋白質(zhì)，硫化物的含量也相對較高。

厭氧污泥在啤酒廢水的長期馴化中，使得硫化細菌和硫酸鹽還原菌成為優(yōu)勢菌種。污泥樣本中的硫化細菌為第一優(yōu)勢菌屬（在樣本YJR1和YJR2中的占比分別為13.83%、9.88%），明顯高于普通厭氧污泥中與硫相關(guān)含量最高的菌屬（占比在1%左右）。樣本中TOP10的菌屬有一些與硫及硫酸鹽的氧化還原反應有關(guān)，這可能是由于磷營養(yǎng)源缺乏不能提供能量，從而利用硫及硫酸鹽的氧化還原反應產(chǎn)生能量，供反應器穩(wěn)定運行。

2.2.3 物種差異比較

基于物種分類結(jié)果，計算在不同水平上各rank的豐度，比較樣本或組間豐度差異，找出樣本或組間豐度存在顯著差異的物種分類，默認只做門和屬的水平，篩選條件為p≤0.05。當比較對象為樣本時，采用fisherexacttest，將檢驗得到的p值采用FDR做Multipletestcorrection得到q值。

在門水平上樣本YJR1與YJR2物種差異比較的誤差線見圖4。中間所示為95%置信度區(qū)間內(nèi)，物種分類豐度的差異比例，當p<0.05時，表示差異顯著，物種分類用紅色標識。由圖4可知，有10種菌門的p值小于0.05，其中Chloroflexi、Euryarchaeota、Proteobacteria、Chlorobi的豐度差異比較大，樣本YJR2中Chloroflexi的豐度較高，可能是因為取樣位置在反應器下端，厭氧條件充分，有利于代謝碳水化合物，另外，下端水浴循環(huán)溫度適宜也是原因之一。Proteobacteria的豐度與氧含量有關(guān)。YJR1樣本中Chlorobi豐度較高可能與頂端少量光照有關(guān)。厚壁菌門（Firmicutes）和擬桿菌門（Bacteroidetes）是產(chǎn)甲烷過程的優(yōu)勢菌群，兩者的相互作用可提高厭氧消化過程的穩(wěn)定性，降低環(huán)境因素變化對消化過程的沖擊。

在屬水平上樣本YJR1與YJR2物種差異比較的誤差線見圖5。

圖5中列出的24種菌屬的p值均在0.05以下，其中Chlorobium、Longilinea、Methanothrix、Levilinea豐度差異較大。樣本YJR1中Chlorobium豐度較高與光照有關(guān)，Methanothrix豐度較高是由于反應器下端主要完成厭氧消化中水解發(fā)酵階段，上端進行嗜乙酸產(chǎn)甲烷階段。樣本YJR2中Longilinea豐度較高是由于下端進污水，受到有機物沖擊較大，所以需要更多細菌水解發(fā)酵，促進產(chǎn)甲烷菌增長以更有利于降解大分子有機物。

2.2.4 功能豐度

通過分析已有測序微生物基因組的基因功能構(gòu)成及16SrDNA測序獲得的物種構(gòu)成等，推測樣本中基因功能的構(gòu)成。樣本YJR1的基因功能豐度見圖6。樣本YJR1所具有的功能主要為［R］（僅限一般功能預測）、［E］（氨基酸運輸和代謝）、［G］（碳水化合物的運輸和代謝）、［S］（功能不明）、［C］（能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換）、［M］（細胞壁/膜/包膜的生物生成）、［K］（轉(zhuǎn)錄）、［P］（無機離子運輸和代謝）、［J］（翻譯，核糖體結(jié)構(gòu)和生物生成）、［L］（復制、重組和修復）、［T］（信號轉(zhuǎn)導機制）。其中，微生物功能預測，氨基酸運輸和代謝，碳水化合物的運輸和代謝，能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換，細胞壁/膜/包膜的生物生成，微生物的轉(zhuǎn)錄、重組和修復，信號轉(zhuǎn)導機制等功能作用顯著。

2.3 古細菌分析

2.3.1 門水平的優(yōu)勢菌群分布特征

樣本中古細菌群落結(jié)構(gòu)門水平上的多樣性較低，共檢出3個門：廣古菌門（Euryarchaeota）、泉古菌門（Crenarchaeota）、浮霉菌門（Planctomycetes）。其中，廣古菌門（Euryarchaeota）占比最高，為99.97%（YJR1）和99.9%（YJR2），產(chǎn)甲烷古菌屬于該菌門；泉古菌門（Crenarchaeota）占比較低，為0.03%（YJR1）和0.1%（YJR2），具有依賴硫的特點，可能是海洋環(huán)境中最豐富的古細菌；浮霉菌門（Planctomycetes）在兩個樣本中極其微量，占比幾乎為0，屬于兼性厭氧菌，能利用糖類作為主要碳源、降解有機物、參與氮循環(huán)。

2.3.2 屬水平的優(yōu)勢菌群分布特征

樣本中古細菌群落結(jié)構(gòu)在屬水平上的多樣性也較低，共檢出14個屬，優(yōu)勢菌屬為Methanothrix、Methanobacterium。Methanothrix在兩個樣本中占比最高，為97.04%（YJR1）和97.44%（YJR2），可將乙酸分解為CH4和CO2；Methanobacterium的占比為2.26%（YJR1）和1.11%（YJR2），是不活動的厭氧菌。它們普遍存在于一些炎熱、低氧的環(huán)境中。

2.3.3 物種差異比較

在門水平上樣本YJR1與YJR2中的古細菌物種差異并不明顯，這是由于污泥中的古細菌種類較少，主要是產(chǎn)甲烷古菌。廣古菌門（Euryarchaeota）中產(chǎn)甲烷古菌是能夠以乙酸、H2/CO2、甲基化合物等為原料生成甲烷的微生物。

3、結(jié)論

①UASB試驗裝置啟動成功歷時60d左右，COD去除率穩(wěn)定在70%左右，基本符合啤酒廢水處理廠COD的去除狀態(tài)。

②經(jīng)高通量測序分析，模擬低磷啤酒廢水UASB處理系統(tǒng)中細菌的優(yōu)勢菌屬為Chlorobium、Longilinea、Methanothrix、Levilinea等，它們的主要功能是分解代謝多種碳水化合物生成有機酸、硫及硫酸鹽等；古細菌的優(yōu)勢菌屬主要為Methanothrix、Methanobacterium，它們的主要功能是以乙酸、H2/CO2、甲基化合物等為原料生成甲烷。

③污泥中細菌和古細菌的功能與啤酒廢水中的污染物有明顯的對應關(guān)系，表明高通量測序有效。與其他常規(guī)厭氧污泥相比，處理模擬低磷啤酒廢水的厭氧污泥中硫化細菌和硫酸鹽還原菌含量較高，為優(yōu)勢菌種，它們能夠進行氧化還原反應為其他厭氧菌種提供能量，使反應器運行穩(wěn)定。（來源：沈陽建筑大學市政與環(huán)境工程學院，沈陽水務集團有限公司）