環(huán)氧樹脂生產(chǎn)廢水中含有大量NaCl，對(duì)生化處理干擾極大，處理難度和處理成本很高，屬于典型的高鹽度難降解工業(yè)廢水。目前對(duì)此類高含鹽廢水的處理方法主要有物化法、生物法和物化-生化聯(lián)合法等。自然界中的耐鹽菌生活在鹽湖、鹽堿湖和海水中，耐受鹽度最高可達(dá)20%，這些耐鹽菌的存在為高鹽廢水的生物處理提供了可能。近年來耐鹽菌已應(yīng)用于榨菜腌制廢水、高含鹽皂化廢水等高鹽廢水的處理，其中耐鹽菌的篩選成為生化處理的關(guān)鍵步驟。本研究從廢水生化處理系統(tǒng)的活性污泥中分離篩選獲取耐鹽菌，進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定及生長(zhǎng)特征考察，研究耐鹽菌在環(huán)氧樹脂廢水的降解特性，以期為此類含鹽樹脂廢水的處理提供技術(shù)支持。

　　1、材料與方法

　　1.1 實(shí)驗(yàn)材料

　　實(shí)驗(yàn)用水取自上海某化工廠環(huán)氧樹脂生產(chǎn)混合廢水，經(jīng)Fenton氧化預(yù)處理后稀釋，并補(bǔ)充適量營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，其水質(zhì)如表1所示。

　　菌種來源：上海某化工廠及某城鎮(zhèn)污水處理廠生化處理系統(tǒng)中的活性污泥。

　　無機(jī)鹽培養(yǎng)基：MgSO4?7H2O0.2g/L，KH2PO40.5g/L，NH4Cl0.5g/L，K2HPO41.5g/L，NaCl(5~200g/L，按需調(diào)節(jié))，1mL微量元素溶液。微量元素：CoCl22g/L，NiCl?26H2O0.05g/L，ZnCl20.05g/L，CuCl20.03g/L，F(xiàn)eCl?36H2O2g/L，MnCl20.5g/L，EDTA1g/L，pH為7.0。

　　斜面培養(yǎng)基：蛋白胨10g，牛肉膏5g，NaCl5g，KH2PO42g，NH4Cl1g，蒸餾水1000mL，瓊脂20g，pH為7.0。

　　1.2 實(shí)驗(yàn)方法

　　1.2.1 耐鹽菌株篩選

　　采用逐步提高NaCl濃度對(duì)耐鹽菌群進(jìn)行篩選培養(yǎng)。從上述2種污泥中各取2.5g，加入滅菌的裝有100mL無菌水的250mL三角瓶?jī)?nèi)，并加入質(zhì)量為無菌水0.01%的焦磷酸鈉，搖床震蕩將菌膠團(tuán)打碎。用無菌移液管吸取上述泥水混合物，在150r/min、37℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)72h后，以10%(體積分?jǐn)?shù))的接種量轉(zhuǎn)入NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中馴化培養(yǎng)(每代3組平行實(shí)驗(yàn)，傳至10代)，直至無機(jī)鹽培養(yǎng)基中的NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到15%，馴化結(jié)束。將馴化得到的菌株接種至含有環(huán)氧樹脂生產(chǎn)廢水(COD1000mg/L)的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，37℃下?lián)u床培養(yǎng)72h，得到目的菌種篩選結(jié)束。

　　挑取上述分離出的單菌落，用涂布法瓊脂平板分離后，將瓊脂平板倒置37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)72h。待瓊脂平板上的菌種長(zhǎng)成菌落后，接種保存于斜面培養(yǎng)基上富集，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

　　采用經(jīng)典分類法與16SrDNA序列分析相結(jié)合的方法確定菌株分類種屬。對(duì)篩選后的活化菌株測(cè)序，在Genebank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對(duì)，以獲得最相近的典型菌株16SrDNA基因序列，與數(shù)據(jù)庫中相似性高的典型菌株序列用ClustalX1.8軟件進(jìn)行對(duì)位排列，用MEGA6.1軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

　　1.2.2 菌株生長(zhǎng)曲線

　　2菌株生長(zhǎng)曲線用NaCl調(diào)節(jié)無機(jī)鹽培養(yǎng)基鹽度梯度(質(zhì)量分?jǐn)?shù))為2%、4%、6%、10%，用NaOH溶液準(zhǔn)確調(diào)節(jié)pH至7.0。富集后的菌株在液體無機(jī)鹽培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)，然后分別取10mL菌懸液接種到100mL含不同濃度NaCl的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，于37℃搖床恒溫好氧培養(yǎng)，每2h取樣1次測(cè)定菌液OD600

　　以上培養(yǎng)基及藥劑分別在121℃高壓滅菌30min后備用。

　　1.2.3 耐鹽組合菌投加比的確定

　　用上述耐鹽菌篩選得到耐鹽菌X1、X2、X3，保持各自菌懸液的OD600在1.2左右，規(guī)定每1mL菌懸液為1份。按正交試驗(yàn)表將菌懸液組合成所需比例，取5mL復(fù)合菌懸液投加至50mL廢水中，置于生物搖床中37℃培養(yǎng)24h，測(cè)定水中COD，考察各種組合比例的廢水處理效果，以確定最佳比例。

　　1.2.4 投加耐鹽組合菌的生物處理

　　環(huán)氧樹脂生產(chǎn)混合廢水經(jīng)Fenton氧化預(yù)處理后，調(diào)整至適宜鹽度并補(bǔ)充適量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，取處理后的廢水50mL加入250mL三角瓶中，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)條件分別加入耐鹽組合菌懸液，考察其對(duì)廢水COD的去除情況。

　　1.3 分析方法

　　OD600由UV-4802H紫外分光光度計(jì)測(cè)定也尤尼柯(上海)儀器有限公司頁，CODCr按HZ-HJ-SZ-0108測(cè)定，氨氮按HJ535要2009測(cè)定，pH測(cè)定采用pHS3C型pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)。

　　2、結(jié)果與討論

　　2.1 耐鹽菌株的篩選

　　2種混合活性污泥經(jīng)馴化篩選、富集培養(yǎng)和分離純化后，共篩選出3株耐鹽菌，分別命名為X1、X2、X3。用GenBankBlast軟件進(jìn)行序列同源性比較，3株菌株均表現(xiàn)出高度的同源性，16SrDNA序列分析為基礎(chǔ)構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1所示，分別確定菌株X1為產(chǎn)堿菌(Alcaligenes)、X2為假單胞菌(Pseudo鄄monas)、X3為芽孢桿菌(Bacillus)，具有耐鹽性。

　　2.2 耐鹽菌株生長(zhǎng)曲線

　　以菌液OD600為縱坐標(biāo)，培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，分別繪制3株耐鹽菌株的生長(zhǎng)曲線，如圖2所示。

　　由圖2可知，X1、X2能在質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%~10%的NaCl環(huán)境中生長(zhǎng)，X3可在2%~6%的NaCl環(huán)境中生長(zhǎng)，但鹽度對(duì)菌株生長(zhǎng)速率有很大影響。隨著鹽度的增加，菌株生長(zhǎng)曲線的適應(yīng)期變長(zhǎng)，對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的生長(zhǎng)速率變慢。適應(yīng)期變長(zhǎng)的原因在于，接種到不同的鹽度環(huán)境后，微生物需經(jīng)過一定時(shí)間的調(diào)整和適應(yīng)，自身合成多種酶進(jìn)一步完善體內(nèi)的酶系統(tǒng)后，才會(huì)生長(zhǎng)繁殖。而在高鹽環(huán)境下酶合成速度下降，產(chǎn)生新的酶系統(tǒng)需要耗費(fèi)一定時(shí)間。在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期微生物雖然處于營(yíng)養(yǎng)過剩狀態(tài)，但對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期增長(zhǎng)速率變慢。高鹽環(huán)境下微生物在抵御外在不良環(huán)境的同時(shí)，需要耗費(fèi)大量能量調(diào)整自身的代謝途徑，或分泌胞外多聚物抵御外界不良環(huán)境因子的作用，同時(shí)需要能量合成自身生長(zhǎng)所需物質(zhì)。這樣導(dǎo)致用于生長(zhǎng)繁殖的能量相對(duì)減少，自身生長(zhǎng)速率變小，世代時(shí)間變長(zhǎng)。減速生長(zhǎng)期歷時(shí)變長(zhǎng)可能是由于微生物利用底物的速率下降，微生物存活率低，導(dǎo)致營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)剩余。

　　2.3 耐鹽組合菌的生物處理

　　2.3.1 耐鹽組合菌投加比的確定

　　研究表明，利用優(yōu)勢(shì)菌株(如耐鹽菌)降解有機(jī)污染物已成為有機(jī)廢水處理的有效方法，其中微生物菌群處理有機(jī)物的效率要高于單一菌株。因此，對(duì)已分離出的3株耐鹽菌用正交試驗(yàn)確定X1、X2、X3組合比例，以獲得高效處理環(huán)氧樹脂生產(chǎn)廢水的復(fù)合耐鹽菌群。正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

　　由表2可見，最優(yōu)水平組合為A2、B2、C3，故3種耐鹽菌X1：X2：X3最佳投配比為2：2：3(體積比)。

　　2.3.2 耐鹽組合菌對(duì)Fenton預(yù)處理廢水的降解效果

　　實(shí)驗(yàn)固定4個(gè)因素，調(diào)整另一因素，考察廢水COD的去除效果，如表3、圖3所示。

　　(1)鹽度。由圖3(a)可見，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%~8%時(shí)，組合耐鹽菌對(duì)廢水中有機(jī)物的降解效果在80%以上。當(dāng)NaCl為15%時(shí)，COD去除率急劇下降，這是由于隨著鹽度增加，菌株生長(zhǎng)速率變慢，酶的合成受到限制，有機(jī)物降解速率減慢。故組合微生物最適NaCl為5%~8%。

　　(2)反應(yīng)時(shí)間。由圖3(b)可見，生物搖床37℃恒溫反應(yīng)6h，廢水COD去除率達(dá)54%，反應(yīng)12h后去除率在70%左右，24h后去除率上升了3%，隨著接觸時(shí)間的延長(zhǎng)，12~48h內(nèi)COD去除率沒有明顯變化，仍保持在80%以下。

　　(3)溫度。圖3(c)中廢水COD去除率隨著溫度的升高逐漸升高，在37℃時(shí)達(dá)到最大值91%左右，當(dāng)溫度達(dá)到40℃時(shí)，COD去除率反而降低，主要是因?yàn)楦邷貢?huì)抑制微生物的活性，從而降低廢水COD去除率，故組合耐鹽菌降解有機(jī)物的最適溫度為37℃。

　　(4)pH。圖3(d)顯示，pH為7時(shí)廢水COD去除效果理想，COD去除率達(dá)到85%左右，pH為5、6時(shí)，COD去除率分別在73%、65%左右，pH為9時(shí)，COD去除率只有30%左右。因此，耐鹽組合菌在pH為7時(shí)COD去除效果最理想，pH過低或過高均會(huì)影響微生物的活性，減少有機(jī)物的降解率。

　　(5)投菌量。由圖3(e)可見，廢水COD去除率隨投菌量的增加而不斷增加，投菌量為5%時(shí)COD去除率比3%時(shí)的去除率明顯提高，菌體投加量為5%、10%時(shí)，COD去除率分別為80%、94%。投菌量為12%時(shí)COD去除率為98%，但相對(duì)于10%的降解率增幅有限，故選擇最佳投菌量為10%。

　　綜上所述，在適合耐鹽菌生長(zhǎng)環(huán)境下，用其處理Fenton預(yù)處理后的廢水，COD去除率維持在70%~80%。通過單因素試驗(yàn)確定最佳實(shí)驗(yàn)條件：廢水pH為7，反應(yīng)時(shí)間為24h，反應(yīng)溫度37℃，廢水中NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%~8%，耐鹽組合菌最佳投加量為廢水體積的10%。

　　3、結(jié)論

　　(1)對(duì)環(huán)氧樹脂生產(chǎn)廢水處理系統(tǒng)及城鎮(zhèn)污水處理生化池中的活性污泥進(jìn)行馴化，篩選出3株能高效降解廢水COD又可在高鹽度環(huán)境中生長(zhǎng)良好的耐鹽菌，命名為X1、X2、X3。采用16SrDNA序列分析方法進(jìn)行鑒定，分離篩選得到3株耐鹽菌株分別為X1屬產(chǎn)堿菌(Alcaligenes)、X2屬假單胞菌(Pseudomonas)、X3屬芽孢桿菌(Bacillus)。

　　(2)通過正交試驗(yàn)確定3株菌株組合最佳投配比為2：2：3(體積比)，用該組合菌處理Fenton預(yù)處理后鹽度為5%~8%的廢水，耐鹽組合菌最佳投加量為廢水體積的10%，在pH為7、37℃下?lián)u床反應(yīng)時(shí)間24h，能保持較高的COD去除率。(來源：中海油天津化工研究設(shè)計(jì)院有限公司)